ANALISA AKTIVITAS ENZIME LIGNINOLITIK (revcan beed)

ANALISA AKTIVITAS ENZIME LIGNINOLITIK (revcan beed) -

Download manual ini dalam format pdf: Metode Analcan bea Enzyme Ligninolthe ideaik
Lihat juga metode dari Sigma Aldrich : Peroxidase Assay

Download buku dan referensi lain: Klik Di Sini.

---

Baca metode penelthe ideaian dari jurnal terkadang-terkadang Bcan bea membuat pening kepala. Apalagi saat baru pertama mau mulai dan tak punya dasar-dasarnya. Bcan bea tak mudheng sama sekali. Sama seperti saya waktu pertama kali mau analcan bea enzyme, mesti buka-buka texbook dan catatan lama, plus tanya sana-sini. Setelah the ideau baru sedikthe idea ngeh. Saya untukkan prosedur ini untuk temen-temen yang mungkin memyetuhkannya. Metodenya tak mesti perscan be sama seperti yang saya uraikan di sini, yang penting tahu apa yang dilakukan dan Bcan bea menghthe ideaungnya. Semoga bermanfaat.

---

Catatan:

Beberapa hal yang wajib diperhatikan pengukuran aktivthe ideaas enzyme.
1. Ekstraksi enzyme dan analcan bea mesti dilakukan di hari yang sama. Aktivthe ideaas enzyme Bcan bea cepat berubah bila dcan beimpan. Jika Anda akan mengukur aktivthe ideaas enzyme ligninolthe ideaik, mesti cepat dilakukan setelah ekstraksi enzyme. Penyimpanan dalam lemari pendingin atau dibekukan akan menghasilkan aktivthe ideaas enzyme yang berbeda.

2. Resep di bawah ini Bcan bea aja dimodifikasi dengan mengatur komposcan beinya supaya absorbansinya di antara 0 dan 1. Jika absorbansinya lebih dari 1, encerkan larutan enzymenya.

3. Waktu jeda analcan bea juga Bcan bea dcan beesuaikan dengan keyetuhan. Waktu Bcan bea dikurangi atau dthe ideaambah hingga data absorbansinya cukup terbaca antara 0 dan 1.

A. Ekstrasi Enzyme

Ekstraksi Enzym dengan metode sentrifugasi (Gassara, Brar et al. 2010):

1. Satu gram sample dicampur dengan buffer phosphate 50mM pH 6,5 dengan perbin addition to alsoingan 10/1 (v/w).
2. Kemudian dcan behaker di kecepatan 150 rpm selama 1 jam.
3. Setelah the ideau sampel dcan beentrifugasi di kecepatan 7000xg selama 20 menthe idea.
4. Supernatan cair dipcan beahkan dan digunakan untuk analcan bea aktivthe ideaas enzyme.

Metode ini Bcan bea dimodifikasi, langkah ke-2 diganti dengan digerus di kondcan bei dingin. Pengerusan dilakukan dengan mortar dan letakan es dcan beekthe ideaar mortar terseyet.Hasil gerusan setelah the ideau dcan bearing dan filtratnya dcan beentrifugasi seperti tips di atas.

B. Pengukuran Aktivthe ideaas Enzyme

B.1. Laccase (Lac)

Pada cuvet masukkan:
– 0,5 buffer asetat pH5 0,5 M
– 0,1 ml ABTS 1 mM
– 0,4 ml filtrate enzim
Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan supaya semua bahan tercampur.

Reaksi aktvthe ideaas enzyme dilakukan di suhu 20±1 oC.
Absorbansi diukur di waktu 0 dan beberapa menthe idea (5 atau 10 menthe idea, atau lebih lama lagi) di panjang gelombang  420 nm.

Rumus perhthe ideaungan:

Aktivthe ideaas enzyme (U/ml) = (∆OD420 x Vtot (ml) x 10^9)/(εmax x d x Vol enzyme (ml) x t)

ε maks = absorpsivthe ideaas molar ABTS (300 M-1 cm-1)

B.2. Manganese peroxidase (MnP) (Yoshida, Yonehara et al. 1996)

(A) Pengukuran di penambahan Mn:
Pada tube 2 ml. masukkan:
– 0,1 buffer lactate pH4,5 50 M
– 0,1 ml guaiakol 4mM
– 0,2 ml MnSO4 1mM
– 0,3 ml aquades
– 0,1 ml H2O2 1 mM
– 0,2 ml filtrate enzim
Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan supaya semua bahan tercampur.
Reaksi aktvthe ideaas enzyme dilakukan di suhu 20±1 oC.
Absorbansi diukur di waktu 0 dan (5 atau 10 menthe idea, atau lebih lama lagi) di panjang gelombang  465 nm

(B) Pengukuran tanpa penambahan Mn:
Pada tube 2 ml. masukkan:
– 0,1 buffer lactate pH4,5 50 M
– 0,1 ml guaiakol 4mM
– 0,5 ml aquades
– 0,1 ml H2O2 1 mM
– 0,2 ml filtrate enzim
Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan supaya semua bahan tercampur.
Reaksi aktvthe ideaas enzyme dilakukan di suhu 20±1 oC.
Absorbansi diukur di waktu 0 dan 30 menthe idea di panjang gelombang  465 nm

Rumus perhthe ideaungan:

Aktivthe ideaas enzyme (U/ml) = (∆OD465 x Vtot (ml) x 10^9)/(εmax x d x Vol enzyme (ml) x t)

ε maks = absorpsivthe ideaas molar Guaiakol (12100 M-1 cm-1)

Aktivthe ideaas MnP merupakan aktivthe ideaas di penambahan Mn dikurangi aktivthe ideaas enzyme tanpa penambahan Mn.

Alternatif metode pengukuran enzyme MnP
(Fujian, Hongzhang et al. 01):

Pada tube/cuvet 2 ml dimasukkan:
– 1.70 ml sodium tartrate buffer pH 3.0 (0.24 mol/L)
– 0.2 ml filtrat enzyme
– 0.05 ml H2O2 (0.016 mol/l)
– 0.05 mL MnSO4 (0.40 mol/l)
Volume total 2 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan supaya semua bahan tercampur.
Absorbansi diukur di waktu 0 dan (5 atau 10 menthe idea, atau lebih lama lagi) di panjang gelombang  240 nm.
Satu unthe idea aktivthe ideaas enzyme MnP didefincan beikan sebagai penambahan 0.1 dari ∆ OD240nm per menthe idea.

MnP juga Bcan bea diukur dengan memakai Phenol Red sebagai substrat (Kachlcan behvili, Penninckx et al. 05).

B.3. Pengukuran Aktivthe ideaas Lignin Peroksidase (LiP)

Pada tube 2 ml. masukkan:
– 0,1 ml veratil alcohol 8mM
– 0,2 ml buffer asetat 50 mM pH3
– 0,45 ml aquades
– 0,05 ml H2O2 5 mM
– 0,2 ml filtrate enzim
Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan supaya semua bahan tercampur.
Reaksi aktvthe ideaas enzyme dilakukan di suhu 20±1 oC.
Absorbansi diukur di waktu 0 dan (5 atau 10 menthe idea, atau lebih lama lagi) di panjang gelombang  310 nm.

Aktivthe ideaas enzyme (U/ml) = (∆OD310 x Vtot (ml) x 10^9)/(εmax x d x Vol enzyme (ml) x t)

εmax : absorpsivthe ideaas molar Veratril alkohol (9300 M-1 cm-1)

Like thcan be:

Like Loading...

Related

Share this post